Prelievo e frazionamento dei campioni ematici

Quando prelevare

  • Accertare l'idoneità del donatore (anamnesi, questionario e consenso).
  • Prelevare campioni di sangue contemporaneamente alla donazione con un margine consentito di  7 giorni dopo
  • Evitare di prelevare dopo o durante emodiluizione poiché potrebbe essere causa di falsi negativi.

Che cosa prelevare

  • 2 provette di sangue intero (vacutainer tappo viola), con anticoagulante EDTA, miscelate delicatamente per inversione: questi campioni sono destinati alla BTM IOR.
  • NON utilizzare eparina, come anticoagulante, poiché è dimostrato che inibisce le metodiche PCR.
  • Inviare immediatamente le provette prelevate al servizio che si occupa del frazionamento e dello stoccaggio dei sieri.
  • Per le analisi di primo livello eseguite presso i vostri laboratori, comportarsi come di consueto, secondo le procedure interne. Devono comunque essere eseguite sul campione di sangue prelevato contemporaneamente alla donazione o entro i 7 giorni seguenti.  Se non è possibile, sarà la BTM a farle eseguire sul campione corrispondente alla donazione, al momento della consegna dei plasmi e dell’epifisi congelata.
TEST SIEROLOGICI OBBLIGATORI

Sul tema cfr. Accordo della Conferenza permanente per i rapporti tra lo Stato, le Regioni e le Province Autonome di Trento e Bolzano dell'8 marzo 2018 - Requisiti minimi organizzativi, strutturali e tecnologici degli Istituti dei tessuti per la qualità e la sicurezza nella donazione, l'approvvigionamento, il controllo, la lavorazione, la conservazione, lo stoccaggio e la distribuzione di tessuti e cellule umane (consulta in questa sezione).

In caso di positività ad uno dei seguenti test obbligatori, il soggetto risulta non idoneo alla donazione e il tessuto non può essere utilizzato per il trapianto:

  • antigene di superficie del virus dell'epatite B (HBsAg);
  •  anticorpi anti virus dell'epatite C (HCV);
  •  anticorpi anti virus HIV 1 e 2;
  •  TPHA o altro test che rilevi gli anticorpi anti treponema.

È obbligatorio effettuare inoltre la ricerca degli anticorpi anti antigene C dell'epatite B (HBcAb): se il risultato è positivo, in assenza di HBsAg, deve essere eseguita la ricerca degli anticorpi anti antigene s dell'epatite B (HBcAb).

Se HBsAb è positivo, il donatore è idoneo. Se HBsAb è negativo, deve essere effettuata la ricerca di HBV DNA. Se questa risulta negativa con un test in grado di rilevare almeno 50 UI/ml, i tessuti possono essere utilizzati per trapianto.

Stabilità dei campioni

La stabilità dei campioni è influenzata da temperature elevate. I campioni di plasma, inoltre, sono destinati ad essere sottoposti a metodologie di biologia molecolare, che possono essere facilmente soggette a contaminazioni.

  •  Separare il plasma entro 6 ore; è comunque possibile conservare sangue intero tra i 2 - 25° C per non più di 6 ore;  tra 0° e 4° per non più di 72 ore.
  •  Il sangue intero non può essere congelato.
  •  Una volta separato (prima di congelarlo o dopo scongelamento), il plasma può essere conservato tra 2 - 8° C per oltre 72 ore.
  •  Per periodi superiori, come accade nel caso delle aliquote destinate alla BTM, deve essere congelato a '70 o -80° C, in tubi sterili, con tappo di polipropilene.
  • Il plasma non deve essere sottoposto a più di 2 cicli di congelamento/scongelamento.

Frazionamento

  • Centrifugare a 3000 rpm, per 20 minuti.
  • Usare i guanti: sulla superficie cutanea sono presenti RNAsi che potrebbero inficiare i risultati delle analisi eseguite con metodologie NAT.
  • Utilizzare materiale sterile (puntali e cryovials).
  • Il materiale d’uso, originariamente confezionato sterilmente, va mantenuto pulito anche dopo l’apertura della confezione: è quindi importante mantenere chiuso il sacchetto delle cryovials ed il portapuntali; la pipetta va impugnata solo con i guanti, ed è necessario mantenerla pulita.
  • Eseguire il frazionamento in un’area dedicata. Le superfici di lavoro devono essere mantenute pulite e protette da un foglio di carta bibula.
  • Preparare 4 provette sterili cryovials: due da 5 ml e due da 3 ml, mantenendole chiuse, applicando l’etichetta adesiva con l’identificativo del donatore.
  • Stappare esclusivamente le provette del campione da separare.
  • Stappare le provette cryovials solo al momento del frazionamento.
  • Utilizzando gli appositi puntali cotonati, frazionare il plasma nelle 4 cryovials preparate nelle seguenti aliquote: nelle due cryovials da 5 ml  aliquotare almeno 2 ml di plasma, distribuendo il plasma restante nelle due cryovials più piccole. - NB: ogni campione frazionato di plasma deve preferibilmente provenire da entrambe le provette madri.
  • In caso di campioni di più donatori, è buona norma stappare esclusivamente le provette del campione che si sta frazionando, controllando la congruenza dei dati identificativi  (nome su entrambe le provette madri, nome su ogni provetta figlia, nome sul sacchetto o contenitore..).
  • Non prelevare la parte corpuscolata, contaminando il plasma.
  • Segnalare la presenza di emolisi o campioni lipemici.
  • Utilizzare provette cryovials provviste di tappo a vite esterno: le provette con tappo a vite interno, infatti, al momento dello scongelamento, causano pericolose fuoriuscite di siero, rimasto adeso al tappo; raccomandiamo il modello con tappo di chiusura esterno (tipo cryovials sterili, con tappo di propilene) da 5 e da 3 ml. - NB: la BTM è disponibile a fornire le cryovials su richiesta.

Identificazione

  • Non utilizzare etichette che si staccano, al momento dello scongelamento né di dimensioni tali da aumentare il volume della provetta (così non più inseribile negli appositi box per la crioconservazione), costringendo a staccarle (con conseguente rottura della stessa etichetta e rischi di errori nell'identificazione del campione)
  • Non impedire l'osservazione diretta del plasma contenuto, coprendo tutta la superficie con l'etichettatura.
  • Preferibile scrivere direttamente sulla provetta, ma sempre con pennarelli di accertata resistenza all'acqua.
  • Impostare istruzioni di lavoro che standardizzino l'operatività, con un sistema di accurato controllo dell'anagrafica, per evitare il più possibile rischi di errori pre-analitici.

Invio alla BTM

  • Al momento del trasporto alla Banca di riferimento, le condizioni di confezionamento e di trasporto devono essere tali da mantenere lo stato di congelamento.
  • Trasporti per tragitti lunghi, nei periodi di alta temperatura ambientale, richiedono l'utilizzo di ghiaccio secco.
  • Deve essere garantito il trasferimento alla BTM entro un mese dal prelievo, al fine di non compromettere l’esecuzione dei test NAT e l’attribuzione del codice unico identificativo.

Vedi le diapositive: Trattamento dei campioni ematici.

Contenuto aggiornato il 05/09/2019 - 09:16
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